Desenvolvimento de abordagem de hidrólise de proteínas para aumentar os benefícios nutricionais de carnes e peixes preparados na hora.
Um documento de apoio científico do Dr. Adrian Hewson-Hughes | Consultor de Nutrição, Segurança Alimentar e Inovação, GA Pet Food Partners.
Introdução.
O teor de proteína animal está bem estabelecido como sendo a essência dos alimentos de qualidade premium para cães e gatos, e muitos donos de animais reconhecem que o ditado “qualidade sobre quantidade” se aplica aqui. De acordo com a empresa de pesquisa de mercado Mintel, 59% dos donos de gatos e 57% dos donos de cães dizem que a qualidade da carne é mais importante do que o conteúdo geral de carne nos alimentos para animais de estimação. (MINTEL, 2017).
GA Pet Food Partners há muito reconhece isso. Desde a introdução de Freshtrusion®, a GA liderou o desenvolvimento e fabricação de dietas contendo quantidades crescentes de fontes de proteína de carne e peixe preparadas na hora. Os benefícios do uso de fontes de carne e peixe frescas em vez de refeições de carne e peixe secas e processadas, incluindo melhor sabor e maior digestibilidade, são bem apreciados pelos animais de estimação e seus donos.
Buscando oferecer aos nossos Parceiros produtos ainda melhores.
O mercado de alimentos para animais de estimação é muito dinâmico e, embora destacar a proporção exata de carne/peixe/aves nos produtos seja uma jogada inteligente, isso está se tornando uma expectativa básica e não a qualidade desejada para esses produtos pelos donos de animais de estimação. Aqui na GA, estamos constantemente nos esforçando para oferecer aos Parceiros produtos ainda melhores, e é por isso que nos propusemos a fazer o aparentemente impossível - criar uma maneira de cozinhar nossos ingredientes de carne e peixe frescos para torná-los ainda melhores para animais de estimação .
A ideia é aumentar o valor nutricional da proteína em nossos ingredientes frescos de carne e peixe, convertendo a proteína em pequenos peptídeos, que são mais facilmente absorvidos pelos animais de estimação que a comem (estamos chamando de 'HDP' - Proteína Altamente Digestível). Para nos ajudar nessa busca, identificamos especialistas da Nofima, um instituto líder em pesquisa aplicada de alimentos com sede na Noruega, para otimizar as condições de digestão enzimática de matérias-primas selecionadas de carne e peixe e analisá-las para demonstrar que poderíamos alcançar o que queríamos .
Digestão de Proteínas – também conhecida como Proteólise ou Hidrólise
As proteínas são grandes moléculas compostas de 'blocos de construção' individuais chamados aminoácidos. Depois de comer alimentos contendo proteínas, o processo de proteólise começa quando enzimas liberadas em diferentes partes do trato gastrointestinal o decompõem em aminoácidos e pequenos peptídeos. Isso permite que esses blocos de construção sejam absorvidos pelo corpo, onde podem ser recombinados para construir novas proteínas (como músculo, pele, cabelo, anticorpos, enzimas, hormônios, etc.).
Também é possível que as fontes de proteína passem por um processo de proteólise enzimática controlada como parte de sua preparação para inclusão em alimentos industrializados e produtos nutricionais. Por exemplo, hidrolisados de proteínas são usados há décadas na nutrição humana, principalmente na produção de fórmulas lácteas infantis hipoalergênicas para bebês/crianças alérgicas à proteína do leite de vaca.
Hidrólise Enzimática ou Química
A hidrólise de proteínas – a quebra de ligações peptídicas que unem aminoácidos através da adição de água – pode ser alcançada por diferentes métodos: quimicamente usando ácidos ou bases (alcalinos) ou enzimaticamente (a abordagem em que estamos focando). Enquanto os métodos de hidrólise ácida e alcalina de proteínas oferecem a vantagem de baixo custo, há consequências negativas em termos de qualidade nutricional dos hidrolisados produzidos. A hidrólise ácida resulta na destruição completa do aminoácido essencial triptofano, bem como na perda parcial de metionina, cistina e cisteína (Pasupuleki & Braun, 2010). Da mesma forma, a hidrólise alcalina resulta na destruição completa da maioria dos aminoácidos, embora o triptofano possa sobreviver intacto. (Dai, et ai., 2014), (Hou, et ai., 2017).
Em comparação com a hidrólise ácida e alcalina, as principais vantagens da hidrólise enzimática de proteínas são:
- As condições de hidrólise, como temperatura e pH, são suaves e não resultam em nenhuma perda conhecida de aminoácidos.
- O uso de enzima(s) protease é mais específico e preciso no controle da extensão da hidrólise e do tamanho dos peptídeos.
- As pequenas quantidades de enzima usadas podem ser facilmente desativadas (por exemplo, aquecendo a 80 – 85ºC por pelo menos 3 minutos) para interromper a reação de hidrólise. (Hou, et ai., 2017).
Benefícios nutricionais da proteína hidrolisada enzimaticamente: digestibilidade e absorção da proteína.
Além do método de hidrólise de proteínas utilizado, conforme descrito anteriormente, o valor nutricional dos hidrolisados de proteínas depende da composição de aminoácidos livres, pequenos peptídeos (tipicamente di e tripeptídeos) e grandes peptídeos presentes. Historicamente, acreditava-se que apenas aminoácidos livres eram absorvidos do trato gastrointestinal por transportadores de aminoácidos específicos. Isso ocorre, mas agora é reconhecido que a maioria dos aminoácidos é absorvida como di e tripeptídeos pelo transportador peptídico de ampla especificidade PepT1 (Fé, et ai., 1994). PepT1 pode potencialmente transportar todos os 400 dipeptídeos e 8,000 tripeptídeos que resultam da combinação dos 20 aminoácidos dietéticos diferentes (Daniel, 2004). Portanto, seria esperado que a ingestão de um hidrolisado de proteína contendo altas proporções de di e tripeptídeos facilitasse a digestão e absorção de proteínas, resultando em maior digestibilidade e biodisponibilidade de aminoácidos.
Claramente, estabelecer as melhores condições de enzima e hidrólise é fundamental para poder criar hidrolisados de proteína com os perfis de tamanho de peptídeo finais desejados. A distribuição de tamanho de peptídeo pode ser determinada usando uma técnica chamada cromatografia de exclusão de tamanho. A cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) é uma técnica de química analítica na qual misturas de moléculas (como proteínas ou peptídeos) dissolvidas em uma solução são separadas por seu tamanho (conforme descrito na figura 1).
FIGURA 1. Visão geral simples da separação de moléculas de diferentes tamanhos em uma solução por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC). A solução é aplicada a uma coluna que é empacotada com uma resina de esferas esféricas porosas (esferas cinzentas). Moléculas grandes (círculos vermelhos) não serão capazes de entrar nos poros (buracos) das esferas e, portanto, passarão pela coluna de forma relativamente rápida e serão detectadas primeiro. Moléculas menores dentro da amostra podem entrar nos poros em graus variados, dependendo de seu tamanho. Moléculas de 'tamanho médio' (círculos verdes) poderão entrar em algumas esferas, mas não em outras e, portanto, levarão mais tempo para passar pela coluna, enquanto as moléculas menores (círculos azuis) poderão entrar em todos os poros e levar o mais longo para passar pela coluna.
De Depósito
Alta tecnologia – Amostras frescas de carcaça de frango, carcaça de pato e armações de salmão foram reduzidas, homogeneizadas em uma pasta grossa e congeladas. Fígado de cordeiro fresco foi congelado inteiro. Os materiais foram enviados para Nofima, Ås, Noruega, para proteólise e análise.
Proteólise – Para cada matéria-prima (frango, pato, salmão e cordeiro), uma amostra de 500g foi misturada com 990ml de água destilada em um reator de vidro e agitada a 300rpm. Para cada matéria-prima, três enzimas proteases diferentes foram testadas em duas concentrações diferentes e dois pontos de tempo, resultando em 48 amostras de hidrolisado para análise.
Cromatografia de exclusão de tamanho – A distribuição de peso molecular da fração de proteína solúvel em água dos hidrolisados foi determinada por cromatografia de exclusão de tamanho usando um sistema de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) Shimadzu LC-20AT com um detector de matriz de fotodiodos (SPD M20A) ajustado em 214 nm.
Conteúdo de Peptídeo de Colágeno – A hidroxiprolina é um aminoácido modificado, cuja presença se limita principalmente ao colágeno. O teor de hidroxiprolina em hidrolisados de proteína pode ser usado como uma medida indireta da quantidade de colágeno/peptídeos de colágeno presentes. Uma análise completa de aminoácidos (incluindo hidroxiprolina) de cada matéria-prima foi realizada pela Nofima Biolab; além disso, o teor de hidroxiprolina foi determinado em um laboratório credenciado (ALS, Noruega) na fração solúvel em água dos hidrolisados.
Mensuráveis
Distribuição de tamanhos de peptídeos de hidrolisados – Em geral, para cada enzima testada, a incubação de cada matéria-prima com a maior concentração de enzima e por um período mais longo resultou em uma mudança 'benéfica' no perfil de tamanho do peptídeo dos hidrolisados (ou seja, um aumento na proporção de peptídeos menores ). Isso é destacado na Figura 2, que mostra os resultados para cada matéria-prima usando a 'melhor' enzima na concentração e duração 'não ideais' em comparação com a concentração e duração 'ótimas'. Com condições otimizadas, descobrimos que 100% dos peptídeos eram ≤3 kDa e mais de 75% eram < 0.5 kDa (Figura 2).
Com base na evidência coletiva de vários estudos em várias espécies (por exemplo, rato, porco, cão, humano; ver (Zhangi & Matthews, 2010) para uma visão geral, é geralmente bem aceito que:
- A absorção de peptídeos é melhor em comparação com a proteína intacta.
- A absorção de peptídeos é melhor do que aminoácidos livres.
- A absorção de peptídeos pequenos é melhor do que a de peptídeos grandes.
Fisiologicamente, a maioria dos aminoácidos é absorvida como pequenos peptídeos consistindo de 2 ou 3 aminoácidos unidos (di e tripeptídeos, respectivamente). Portanto, seria esperado que a ingestão de um hidrolisado de proteína contendo altas proporções de di e tripeptídeos facilitasse a digestão e absorção de proteínas, resultando em maior digestibilidade e biodisponibilidade de aminoácidos. O peso molecular médio de um aminoácido é de 110 Daltons (Da), então di e tripeptídeos teriam um peso molecular de aproximadamente 220-330 Da (0.2-0.3 kDa). Nossos resultados em obter hidrolisados de proteína com mais de 75% de peptídeos menores que 0.5 kDa (ou seja, até ~ 5 aminoácidos) significam que a proteína em nossos croquetes seria altamente digerível e facilmente absorvida pelos animais de estimação que a comem. Está planejado demonstrar isso através de um estudo de alimentação em colaboração com a Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade de Ghent.
Além disso, atingir 100% de peptídeos de 3 kDa ou menos diminui o risco de desencadear uma reação alérgica às fontes proteicas e, portanto, pode ser considerado hipoalergênico.
Figura 2. Painel do
Distribuição de tamanho (kDa) de peptídeos na fase aquosa de hidrolisados de cada matéria-prima incubada com a mesma enzima em condições 'não otimizadas' e 'otimizadas' em termos de concentração de enzima e duração da hidrólise. Observe em particular como a porcentagem de peptídeos entre 1.0-3.0 kDa diminui e os peptídeos <0.5 kDa aumentam, passando de condições 'não otimizadas' para 'otimizadas'.
Conteúdo de Peptídeo de Colágeno
Para cada matéria-prima testada, as enzimas A e C tiveram um desempenho "melhor" em geral (em termos de recuperação de uma porcentagem maior de hidroxiprolina na fase aquosa dos hidrolisados) do que a enzima B ao comparar uma determinada duração de hidrólise e concentração de enzima (por exemplo, ver resultados para o salmão na figura 3).
Como a proteína de colágeno 'intacta' não é solúvel em água, a presença de hidroxiprolina (nosso marcador de 'colágeno') na fase aquosa indica que a proteína de colágeno foi digerida em peptídeos de colágeno (que são solúveis em água). Nossos resultados ilustram que somos capazes de usar a proteólise enzimática para criar matérias-primas capazes de trazer benefícios funcionais potenciais, como apoiar a saúde das articulações, da pele e do intestino por meio dos peptídeos de colágeno presentes nelas.
FIGURA 3. Porcentagem de hidroxiprolina (aminoácido encontrado quase exclusivamente no colágeno) recuperada na fase aquosa do salmão hidrolisado com três enzimas diferentes (A, B ou C) incubadas com a matéria-prima (salmão) em duas concentrações diferentes (C1 ou C2) para dois períodos de tempo diferentes (T1 ou T2).
Conclusão
Esses resultados positivos apresentam oportunidades para obter valor extra da presença natural de colágeno em certas matérias-primas, criando peptídeos de colágeno com potencial para fornecer benefícios funcionais, como manter articulações saudáveis em animais de estimação ativos e melhorar a mobilidade e flexibilidade das articulações em animais de estimação mais velhos, para exemplo.
Com a alta porcentagem (>75%) de pequenos peptídeos (<0.5kDa) produzidos em condições 'otimizadas' com base nesta pesquisa, a primeira parte do nosso HDP objetivo é alcançado. O próximo passo importante é demonstrar que a ração feita com este HDP é realmente mais digerível e biodisponível do que nossos produtos recém-preparados existentes - estamos ocupados realizando isso em um estudo de alimentação com o Universidade de Gante Escola veterinária. Assista esse espaço!
Referências
- Cave, N., 2006. Dietas de proteína hidrolisada para cães e gatos. Clínicas veterinárias Small Animal Practice, Volume 36, pp. 1251-1268.
- Dai, Z., Wu, Z., Jia, S. & Wu, G., 2014. Análise da composição de aminoácidos em proteínas de tecidos animais e alimentos como derivados de o-ftaldialdeído pré-coluna por HPLC com detecção de fluorescência. J Cromatografia B, Volume 964, pp. 116-127.
- Daniel, H., 2004. Fisiologia molecular e integrativa do transporte de peptídeos intestinais. Annual Review of Physiology, Volume 66, pp. 361-384.
- Fei, Y. et ai., 1994. Expressão clonagem de um transportador de oligopéptido acoplado a protão de mamífero. Nature, Volume 7, pp. 563-566.
- Hanaoka, K. et al., 2019. Caracterização do peso molecular de proteínas e peptídeos durante a fabricação de palatantes para pet food. [Online] Disponível em: https://www.diana-petfood.com/emea-en/publications/
- Hou, Y. et al., 2017. Hidrolisados proteicos na nutrição animal: Produção industrial, peptídeos bioativos e significado funcional. Jornal de Ciência Animal e Biotecnologia, pp. 24-36.
- Knights, R., 1985. Processamento e avaliação de hidrolisados de proteínas. In: Nutrição para Necessidades Especiais. Nova York: Marcel Dekker, pp. 105-115.
- MINTEL, 2017. Maior transparência em termos de proteína em pet food, sl: MINTEL REPORTS.
- Pasupuleki, VK, Braun, S, 2010. Fabricação de última geração de hidrolisados de proteínas. In: Hidrolisados de Proteínas em Biotecnologia. Nova York: Springer, pp. 11-32.
- Zhangi, B. & Matthews, J., 2010. Importância fisiológica e mecanismos de absorção de hidrolisados de proteínas. In: Hidrolisados de Proteínas em Biotecnologia. Nova York: Springer, pp. 135-177.